Centre de Référence National Neuropathies Périphériques Rares

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Atlas  photographique

Biopsie de nerf

Consultez leTableau des différentes techniques de Biopsie nerveuse (pdf)

Microscopie électronique / Teasing

Ne pas congeler

Taille : Envoyer au moins 1 fragment de nerf de 3 cm de long.

Fixation : placer le tissu dans le fixateur
(9 ml de tampon Soerensen + 1 ml de glutaraldehyde à 25 %) pendant 3 heures à + 4°C.

Transférer le tissu dans le tampon Soerensen et garder à + 4°C jusqu’à l’envoi.

Composition de la solution tampon de SOERENSEN

Solution I : Na2HP04 9,46 g pour 1 litre d’eau distillée.

Solution II : KH2P04 9,05 g pour 1 litre d’eau distillée.

Mélanger 80 ml de solution I + 20 ml de solution II.

Le fixateur et le tampon sont préparés au dernier moment et conservés à + 4°C.

London Resin White (L.R.White)

Techniques

  • Fixation : Glutaraldéhyde 2,5% dans du tampon Soerensen 0,08M pendant 5 heures ou 1 nuit à +4°C.
  • Rinçage: Dans du tampon de Soerensen 0,08M.
  • Inclusion:

– Déshydratation

– Éthanol 30° à +4°C pendant 15 minutes
– Éthanol 50° à +4°C pendant 15 minutes.
– Éthanol 70° à -20°C pendant 10 minutes.
– Éthanol 95° à -20°C pendant 10 minutes.

– Imprégnation

– L.R.White (1 vol.) +Ethanol à 95° (2 vol.) pendant 1 heure à -20°C.
– L.R.White (2 vol.) +Ethanol à 95° (1 vol.) pendant 1 heure à -20°C.
– L.R.White pur 3 fois 1 heure à -20°C.
– L.R.White pur 1 nuit à +4°C.

– Inclusion

L.R.White pur.

Mettre le prélèvement au fond de la gélule, la remplir et la reboucher, puis mettre dans l’étuve à +37°C pendant 5 jours.

Immuno-Fluorescence directe

  • Le nerf est congelé dans l’isopentane refroidi par l’azote liquide
  • Couper le nerf (épaisseur de 7 mm) au cryostat sur lames superfrost
  • Laisser sécher 30 minutes
  • Faire agir les anti-sérums choisis (Ig A-G-M-Kappa-Lambda conjugués à la fluorescéine) dilués au 1/5 pendant 30 minutes à température ambiante, en chambre humide, et à l’abri de la lumière
  • Rincer au PBS 3 fois 20 minutes sous agitation et à l’abri de la lumière
  • Monter avec un milieu aqueux
  • Conserver à -20°C.

Immuno-Fluorescence indirecte (nerf humain normal)

  • Le nerf est congelé dans de l’isopentane refroidi par l’azote liquide
  • Couper le nerf (épaisseur 7 mm) au cryostat sur lames superfrost
  • Laisser sécher 30 minutes
  • Faire agir le sérum du malade dilué au 1/5 pendant 30 minutes à température ambiante, en chambre humide, et à l’abri de la lumière
  • Rincer au PBS 2 fois 10 minutes
  • Faire agir les anti-sérums choisis (Ig A-G-M-Kappa-Lambda conjugués à la fluorescéine) dilués au 1/5 pendant 30 minutes à température ambiante, en chambre humide, et à l’abri de la lumière
  • Rincer au PBS 3 fois 20 minutes sous agitation et à l’abri de la lumière
  • Monter avec un milieu aqueux
  • Conserver à -20°C.

Congélation du nerf

Matériels

  • 1 boite de polystyrène
  • Azote liquide
  • Isopentane
  • Colle (gomme adragante)
  • Bouchon de liège
  • 1 bécher en téflon
  • 1 petite pince
  • 1 lame de rasoir
  • 1 pic

Préparation de la gomme adragante

Faire chauffer l’équivalent d’un verre d’eau, ajouter petit à petit 1 cuillerée à soupe rase de gomme adragante (en poudre), en tournant jusqu’à l’obtention d’une pâte lisse (se conserve au réfrigérateur pendant 1 mois).

Technique

Biopsie du nerf

Récupérer une boite en polystyrène (ex : boite ronde de glace). Faire un trou dans le couvercle de la grandeur du bécher en téflon où l’on mettra l’isopentane.

A partir d’un bouchon de liège, confectionner des supports en coupant le bouchon en 3 avec une lame de rasoir.

Remplir à ras bords la boite en polystyrène, d’azote liquide. Remettre le couvercle sur la boite. Remplir le bécher en téflon d’isopentane et plonger ce bécher dans le trou du couvercle.

Laisser refroidir l’isopentane jusqu’à apparition d’un dépôt blanchâtre au fond du bécher.

 

Sur le support en liège, mettre un peu de gomme adragante.

Coller le nerf face à couper (c’est à dire au niveau de la section) vers le haut. Piquer le dos du support avec un pic et le plonger dans l’isopentane refroidi. Tourner doucement l’ensemble pendant 30 secondes.

Mettre une petite boite en plastique au congélateur à – 80°C avant le début de la technique. Mettre le tout (support + colle + nerf) dans la boite en plastique et conserver à – 80°C.

 

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