Centre de Référence National Neuropathies Périphériques Rares

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Atlas  photographique

Biopsie de peau

Préparation des prélèvements pour envoi au Laboratoire de Limoges

2 prélèvements avec punch biopsie de 3 mm : un en distale, 10 cm au-dessus de la malléole externe et un en proximale 20 cm en-dessous de l’épine iliaque.
Mettre les prélèvements de peau dans le paraformaldehyde à 4 %, bien différencier distal et proximal.

Paraformaldehyde A 4% : dissoudre 2 g de paraformaldéhyde dans 50 ml de tampon phosphate 0,15M ; sous agitation et à 60°c (la solution doit être limpide). Après refroidissement, prendre le Ph=7,4.

Tampon phosphate 0,15M :

Solution A : 35,6g Di-Na–hydrogénophosphate dans 1 L d’H2O
Solution B : 31,2 g Na-Dihydrogénophosphate dans 1 L d’H2O
Mélanger 405 ml de la solution A avec 95 ml de la solution B.
Ajuster à 1 L avec H2O
Ajuster à pH = 7,4 avec la solution B

Conserver le paraformaldehyde 4% à +4°C, au delà d’une semaine conserver à -20°C

 

Envoyer le prélèvement à température ambiante pour réception le lendemain (Chronopost, porteur). Pas d’envoi le jeudi ni le vendredi

Préparation et techniques sur place

Si vous souhaitez réaliser vous-même la technique de biopsies cutanées pour l’étude des fibres nerveuses intra-épidermiques, voici le protocole que nous utilisons :

Préparation :

  1. 1. Fixer la peau 3h dans du PARAFORMALDEHYDE à 4% ;
  2. 2. Rincer le prélèvement 2 fois dans du TAMPON PHOSPHATE ;
  3. 3. Mettre la peau dans du SUCROSE à 10% à 4°C toute la nuit ;
  4. 4. Congeler la peau (ISOPENTANE refroidi dans l’AZOTE LIQUIDE) ;
  5. 5. Faire des coupes de 50µm sur des lames superfrost (3 coupes) ;
  6. 6. Laisser sécher les lames 30 min à l’air ambiant ;
  7.  7. Congeler à – 20°C toute 1 nuit.

Immunologie :

1er jour :

  1. 1. Décongeler les coupes 30 min à l’air ambiant ;
  2. 2. Entourer chaque coupe et mettre les lames dans une chambre humide ;
  3. 3. Bloquer 30 min à température ambiante avec 10% BSA/PBS ;
  4. 4. Préparation de l’anticorps (PGP 9,5) :
    1. a- 1%BSA (1 ml 10% BSA + 9 ml PBS) ;
    2. b- 1% BSA +0,3% TRITON X (1 ml 1% BSA + 3 µl TRITON X) ;
    3. c- PGP 9,5 (1:600) dilué avec 1% BSA + 0,3% TRITON ;
  5. 5. Éliminer la solution de blocage sans laver ;
  6. 6. Mettre l’anticorps primaire sur les coupes ;
  7. 7. Incuber toute la nuit à température ambiante.

2ème jour :

 

  1. 1. Rincer les lames dans 3 bains de PBS ;
  2. 2. Préparation de l’anticorps secondaire CY3 CONJUGATE IgG : diluer CY3 avec 1% BSA 1:50 (bien agiter sur vortex) ;
  3. 3. Mettre l’anticorps secondaire 2h à température ambiante et à l’abri de la lumière ;
  4. 4. Rincer les lames 3 fois dans du PBS ;
  5. 5. Monter les lames avec un milieu de montage aqueux ;
  6. 6. Entourer les lamelles de vernis pour éviter que les coupes se dessèchent ;
  7. 7. Conserver les lames à +4°C, à l’obscurité.
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